組織學研究方法-免疫細胞化學技術﹝immunocytochemical_techinque﹞:

免疫細胞化學技術﹝immunocytochemical_techinque﹞是應用抗原與抗體結合的免疫學原理,檢測細胞內多肽、蛋白質及膜表面抗原和受體等大分子物質的存在與分佈。

 這種方法特異性強,敏感度高,進展迅速,應用廣泛,成為生物學和醫學眾多學科的重要研究手段。

 近年隨著純化抗原和製備單克隆抗體的廣泛開展以及標記技術不斷提高,免疫細胞化學﹝immunocytochemistry﹞的進展更是日新月異,不僅用於許多基本理論的研究,並取得重大突破,而且也用於疾病的早期快速診斷等臨床實際。

 組織的多肽和蛋白質種類繁多,具有抗原性。

 分離純化人或動物組織某種蛋白質,作為抗原注入另一種動物體內,後者即產生相應的特異性抗體(免疫球蛋白﹝immunoglobulin,Ig﹞)。

 從被免疫動物的血清﹝serum﹞中提取出該抗體,再以螢光素、酶、鐵蛋白或膠體金標記,用這種標記抗體處理組織切片﹝tissue_section﹞或細胞,標記抗體即與細胞的相應蛋白質(抗原)發生特異性結合。

 常用的螢光素是異硫氰酸螢光素﹝FITC﹞和四甲基異硫氰酸羅丹明﹝TRITC﹞,在螢光顯微鏡﹝fluorescence_microscope﹞下可觀察螢光抗體抗原複合物。

 常用的酶是辣根過氧化物酶(horseradish_peroxidase,HRP,從辣根菜中提取的),它的底物是3,3'-二氨基、聯苯胺﹝DAB﹞和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黃色產物,可在光鏡和電鏡下觀察。

 鐵蛋白和膠體金標記抗體與抗原的結合,也可在光鏡和電鏡下觀察。

標記抗體民被檢抗原的結合方式有兩種。

 一是直接法,即如上述用標記抗體與樣品中的抗原直接結合。

 這種方法操作簡便,但敏感度不及間接法。

 間接法是將分離的抗體(第一抗體簡稱一抗)再作為抗原免疫另一種動物,製備該抗體(抗原)的抗體(第二抗體簡稱二抗),再以標記物標記二抗。

 先後以一抗和標記二抗處理樣品,最終形成抗原一抗-標記二抗複合物。

 間接法中的一個抗原分子可通過一抗與多個標記二抗相結合,因此它的敏感度較高,而且目前國內外均有多種標記二抗商品供應,使用方便。

 間接法中較常用的是一種稱之為過氧化物酶-抗過氧化物酶複合物法(peroxidase-antiperoxidase_complexmethod,PAS法),該法除需一抗和二抗外,還需製備HRP標記的抗酶抗體,即以HRP作為抗原免疫動物,製成抗HRP抗體,再以HRP標記該抗體製成由3個酶分子與2個抗酶抗體組成的相當穩定的環形PAP複合物。

 標本先後以一抗、二抗和PAP複合物處理後,再以DAB顯色,即可檢測抗原的分佈。

 此法由於細胞內的抗原通過抗體的層層放大而與多個酶分子結合,因此敏感性很強。

免疫細胞化學技術﹝immunocytochemical_techinque﹞近10年來又有新進展,如生物素﹝biotin﹞-親合素﹝avidin﹞等新穎試劑的應用,為檢測微量抗原、受體、抗體開闢了新途徑。

 生物素﹝biotin﹞又稱維生素H,是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(分子量244.31);親合素﹝avidin﹞又稱卵白素,是從卵白中提取的一種糖蛋白(分子量68kD)。

 每個親合素﹝avidin﹞分子有生物素﹝biotin﹞結合的4個位點,二者可牢固結合成不可逆的複合物。

 生物素﹝biotin﹞-親合素﹝avidin﹞的應用大致有三種方法。

①標記親合素-生物素法﹝labelled_avidin-_biotin_method,LAB法﹞:

 將親合素﹝avidin﹞與標記物(HRP)結合,一個親合素﹝avidin﹞可結合多個HRP;將生物素﹝biotin﹞與抗體(一抗與二抗)結合,一個抗體分子可連接多個生物素﹝biotin﹞分子,抗體的活性不受影響。

 細胞的抗原(或通過一抗)先與生物素﹝biotin﹞化的抗體結合,繼而將標記親合素﹝avidin﹞結合在抗體的生物素﹝biotin﹞上,如此多層放大提高了檢測抗原的敏感性。

②橋連親合素-生物素法﹝bridged_avidin-biotin_method,BAB法﹞:

 先使抗原與生物素﹝biotin﹞化的抗體結合,再以游離親合素﹝avidin﹞將生物素﹝biotin﹞化的抗體與酶標生物素﹝biotin﹞搭橋連接,也達到多層放大效果。

③親合素-生物素-過氧化物酶複合物法﹝avidin-biotin-peroxidase_complexmethod,ABC法﹞:

 此法是前兩種方法的改進,即先按一定比例將親合素﹝avidin﹞與酶標生物素﹝biotin﹞結合在一起,形成親合素-生物素﹝biotin﹞-過氧化物酶複合物(ABC複合物),標本中的抗原先後與一抗、生物素﹝biotin﹞化二抗、ABC複合物結合,最終形成晶格樣結構的複合體,其中網路了大量酶分子,從而大大提高了檢測抗原的靈敏度。

 現有配製現成的ABC藥盒商品供應,操作簡便,是目前廣泛應用的一種方法。

 

經筋醫理探源(永康堂‧張老師)

 

永康堂【YCT】~學習自測~

答案

克隆

【B】

女性55歲,腹痛腹脹,嘔吐﹝vomition﹞一天,近三個月來有時腹脹,大便帶粘液,無血漬,查體:體溫36℃,脈搏80次/分,血壓14/10kPa(115/75mmHg),腹脹,未見腸型,腹軟,右下腹可觸及斜行腫塊,質韌壓痛,腹部透視見有一個液氣平面,白細胞9.5×10的9次方/L,中性80%,可能是:※※A、闌尾周圍膿腫;※※B、回盲部腫瘤;※※C、回盲部結核;※※D、克隆病;※※E、回盲部腸套疊

【B】

下列哪種疾病與結腸癌關係最密切:※※A、回盲部結核;※※B、家族性結腸息肉病;※※C、潰瘍性結腸炎;※※D、血吸蟲性肉芽腫;※※E、克隆病

【】

腹瀉伴裏急後重常見於:※※A、沙門菌食物中毒;※※B、直腸癌;※※C、過敏性紫癜;※※D、腸結核;※※E、克隆病

【E】

下列診斷小腸克隆病較為特徵性X線表現是:※※A、多發生於回腸遠端;※※B、「卵石徵」;※※C、「跳躍徵」;※※D、管腔狹窄;※※E、縱行潰瘍

【B】

在小腸壁有增厚、硬化,且發現有肉芽腫之病理變化,最有可能是下列何種疾病所造成:※※A、潰瘍性結腸炎;※※B、克隆氏病﹝Crohn's_disease﹞;※※C、偽膜性結腸炎;※※D、阿米巴大腸炎。(09,師高)

【D】

患者男性,65歲。腹痛、腹脹、停止排氣排便3天,3年前曾行闌尾切除術,立位腹平片示右下腹可見兩個小腸氣液平面,應診斷為:※※A、闌尾殘株炎;※※B、克隆病;※※C、潰瘍性結腸炎;※※D、黏連性腸梗阻;※※E、膽囊炎。

【D】

患者男性,65歲。腹痛、腹脹、停止排氣排便3天,3年前曾行闌尾切除術,立位腹平片示右下腹可見兩個小腸氣液平面,應診斷為:※※A、闌尾殘株炎;※※B、克隆病;※※C、潰瘍性結腸炎;※※D、黏連性腸梗阻;※※E、膽囊炎。

【E】

潰瘍性結腸炎﹝CUC﹞的併發症應除外:※※A、結腸出血;※※B、中毒性巨結腸﹝toxic_magacolon﹞;※※C、結腸狹窄;※※D、癌變;※※E、克隆氏病﹝Crohn's_disease﹞。

【A】

我國對克隆技術是否應該用于人類的立場是:※※A、允許治療性克隆,不允許生殖性克隆;※※B、不允許治療性克隆,允許生殖性克隆;※※C、允許一切克隆;※※D、不允許一切克隆;※※E、以上都不是。

【B】

目前,關于人類胚胎幹細胞研究和應用中道德爭議的焦點問題是:※※A、人類胚胎幹細胞的功能到底如何;※※B、人類胚胎是否是生命、是否應該得到尊重;※※C、人類胚胎發育階段如何劃分;※※D、人類胚胎幹細胞是否可以商品化;※※E、人類胚胎是否可以克隆。

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